3D-тур по Волынской больнице
(495) 620-80-95
Онлайн-запись на консультацию и диагностику
г. Москва, ул. Староволынская, 10
м. Славянский бульвар

ПЦР-диагностика инфекций мочевыводящих путей

Возможность ПЦР-диагностики инфекций мочевыводящих путей, вызванных бактериальными возбудителями.

21 октября 2016 г.

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) продолжают оставаться одними из самых распространенных бактериальных инфекций человека. Наиболее частыми возбудителями являются Escherichia coli, реже встречаются другие представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acinetobacter. Роль грамположительной флоры увеличивается при развитии хронических заболеваний или госпитальных инфекций. Более чем у 20% больных наблюдается ассоциация микробов, при этом грамотрицательные бактерии чаще сочетаются с грамположительными (например: E. сoli и E. faecalis).

ИМП у женщин встречаются гораздо чаще, чем у мужчин, что обусловлено анатомическим строением мочевыделительной системы. В год в среднем 8–15% взрослых женщин страдают от ИМП, тогда как встречаемость ИМП у мужчин той же возрастной группы примерно 1% в год. Серьезную проблему представляет ОИМП (осложненные инфекции мочевыводящих путей), к которым относятся заболевания, характеризуемые наличием функциональных или анатомических патологий в организме. Пациенты, страдающие ОИМП, более остальных склонны к быстрому развитию инфекционного процесса, который, в свою очередь, требует принятия быстрого решения о назначении адекватной терапии.

Диагноз ИМП ставится на основании клинических симптомов и результатов лабораторной диагностики. В качестве методов диагностики ИМП в клинических лабораториях используют проточные цитометры, микроскопию с окрашиванием по Граму, микробиологические методы исследования мочи. Посев мочи на наличие бактерий остается референсным методом исследования, давая представление о качественном и количественном составе микрофлоры, а также чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. Однако, данный метод является достаточно длительным и трудоемким, помимо того существует ряд возбудителей (анаэробная флора, L-формы микроорганизмов), культивирование которых представляет особенную сложность и часто не доступно для клинических лабораторий.

С диагнозом ИМП в микробиологическую лабораторию для рутинной обработки поступает большое количество анализов, требующих разработки и применения быстрых и чувствительных методов обнаружения бактерий в моче. В первую очередь это относится к таким группам пациентов, как беременные, пациенты с бессимптомной бактериурией, дети. Для сокращения времени выдачи результатов актуальной задачей является разработка нового скринингового метода, который позволит быстро выявить отрицательные образцы мочи и даст представление о видовом составе патогенов в исследуемом материале. В этой связи наиболее перспективным выглядит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет быстро и точно проводить идентификацию бактерий путем анализа генетического материала микроорганизмов.

Принцип действия тест-систем по обнаружению основных возбудителей ИМП и бактериурии основан на обнаружении специфичных участков геномной ДНК бактерий с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени. ПЦР «в реальном времени» характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа.

Целью данной работы была оценка возможности нового скринингового метода идентификации патогенов в моче путем количественной ПЦР в режиме реального времени и сравнение полученных результатов с микробиологическими методами исследования.

Материалы и методы

Клинические образцы. Клинико-лабораторное исследование для оценки диагностической чувствительности и специфичности тест-системы проведено на 200 клинических образцах мочи в группе 200 пациентов. Из них 154 (77%) женщины и 46 (23%) мужчин. Средний возраст пациентов составил 30 лет (от 0 до 89). В 20 случаях моча поступала от беременных, 125 образцов поступили с отметкой «обследование», и для 55 пациентов был известен предварительный диагноз: ИМП (n = 11), мочекаменная болезнь, МКБ (n = 9), хронический пиелонефрит (n = 5), почечная колика (n = 4), острый пиелонефрит (n = 3), хронический цистит (n = 3), внутрижелудочковое кровоизлияние (n = 3), пиелонефрит (n = 2), гестационный пиелонефрит (n = 2), нейрогенный мочевой пузырь (n = 2), гидронефроз (n = 3), острый цистит (n = 1), хронический цистит/пиелонефрит (n = 1), хроническая болезнь почек (n = 1), цистит (n = 1), гломерулонефрит (n = 1), гипербилирубинемия (n = 1), острый синусит (n = 1), гепатоспленомегалия (n = 1), врожденная пневмония (n = 1), множественные пороки развития (n = 1).

Микробиологические исследования. Образцы мочи поступали в микробиологическую лабораторию для посева на микрофлору. Посев производили на неселективную среду Уриселект 4 (Bio-Rad, США) для изолирования и подсчета микроорганизмов из мочевого тракта; прямой идентификации E. coli (розовые колонии), Enterococcus spp (синие колонии), Proteus mirabilis (коричневые колонии); предварительной идентификации KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia). Также посев производили на 5% кровяной агар для выделения бактерий рода Streptococcus и определения гемолитических свойств микроорганизмов.

Культивировали при 37 °С в течение 24 часов при аэробных условиях. Выросшие бактерии, количество которых на чашке превышало 10*4 КОЕ/мл, считались возбудителями инфекции. При наличии роста проводили идентификацию выросших микроорганизмов методом MALDI ToF масс-спектрометрии с применением анализатора Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics, Германия)и программного пакета MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия).

Количественная ПЦР в режиме реального времени. Для определения концентрации микробной ДНК в исследуемом образце использовали плазмидные конструкции с клонированной последовательностью целевого продукта ДНК соответствующего возбудителя, растворенные в ТЕ-буфере (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1mM EDTA). Количество копий (геном-эквивалентов) плазмидной ДНК в стоковом растворе соответствовали концентрации 10*10 копий/мл. Затем путем 10-кратных разведений были приготовлены растворы с концентрацией ДНК 10*8—10*2 копий/мл, которые использовали для построения калибровочных кривых. Постановку ПЦР и интерпретацию полученных данных проводили на приборе iCycler IQ5 (BioRad, США) по следующей программе: 94 °С – 1,5 минуты, затем 40 циклов: 95 °С – 10 секунд (денатурация), 64 °С – 11 секунд (отжиг праймеров), 72 °С – 20 секунд (элонгация). Детекция продуктов прибором осуществляется автоматически в каждом цикле амплификации. На основе этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналу. Для расчета количества геном-эквивалентов соответствующих микроорганизмов в клинических образцах параллельно проводили реакцию амплификации с калибровочными образцами в концентрации от 10*8 до 10*2 копий/мл гена 16S rRNA.

Перерасчет количества геном-эквивалента в анализируемых образцах проводили с учетом копийности гена 16S rRNA для каждого детектируемого микроорганизма: Enterococcus sp, Streptococcus sp , Pseudomonas aeruginosae – 4 копии гена, Staphylococcus aureus – 5 копий, E. coli, Proteus sp, Serratia sp – 7 копий и Enterobacter sp – 8 копий гена. Все образцы, цикл выхода которых был ниже 35, считались отрицательными. По завершении всех действий программа автоматически рассчитывает точки пересечения кривых накопления флуоресцентного сигнала каждого образца с пороговой линией, строит калибровочную кривую и рассчитывает концентрацию ДНК в исследуемых образцах.

Результаты

В ходе клинических испытаний были проанализированы 200 образцов мочи. Все образцы после проведения микробиологических исследований поступали в лабораторию ПЦР для выделения ДНК и тестирования на наличие ДНК возбудителей методом количественной ПЦР в режиме реального времени с применением набора «Септоскрин».

Согласно результатам микробиологических посевов в 95 образцах мочи (95/200, 47,5%) роста микроорганизмов не наблюдалось, в 70 образцах (70/200, 35%) обнаружен один бактериальный возбудитель. В 35 образцах мочи (35/200, 17,5%) выявлены полимикробные инфекции, из них в 7 образцах (7/35, 20%) обнаружено более двух патогенов. В случаях мономикробной инфекции наиболее часто выявлялись Escherichia coli (27/70, 38,6%), Enterococcus faecalis (20/70, 28,6%) и Enterococcus faecium (8/70, 11,4%). В 4,3% (3/70) единственным выявленным возбудителем были коагулазонегативные стафилококки, в 2,9% (2/70) — Streptococcus spp. Бактерии KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) в моноинфицированных образцах обнаруживались в 10% случаев (7/70). В оставшихся образцах 4,3% выделенных возбудителей пришлось на долю Candida spp (2/70, 2,9%) и Pseudomonas mosselii (1/70, 1,4%). Среди образцов с полимикробными инфекциями в случаях выявления двух возбудителей доминировало сочетание E. сoli и E. faecalis (11/35, 31,4%). В 6 случаях обнаруживались сочетания бактерий E. coli/K. pneumonia (4/35, 11,4%), и E . faecаlis /Streptococcus spp. (2/35, 5,7%). При выявлении трех и более возбудителей сочетание E. coli / E. faecalis /Staphylococcus spp. было наиболее часто встречаемым (3/7, 42,9%).

Результаты ПЦР. Методом количественной ПЦР в режиме реального времени в 123 образцах (123/200, 61,5%) возбудителей не обнаружено. Из 77 положительных образцов (77/200, 38,5%) один бактериальный возбудитель выявлен в 48 образцах мочи (48/77, 62,3%), два возбудителя — в 16 образцах (16/77, 20,8%), три и более — в 13 образцах (13/77, 16,9%). Среди мономикробных образцов мочи согласно результатам ПЦР бактерии E. coli детектированы в 28 образцах (28/48, 58,3%), в 10 образцах (10/48, 21,8%) обнаружены бактерии рода Enterococcus, в 8 — бактерии группы KES (8/48, 16,7%), в 1 — Staphylococcus aureus (1/48, 2,1%), в 1 – Pseudomonas aeruginosa (1/48, 2,1%). При полимикробных инфекциях методом ПЦР сочетания E. coli и бактерий рода Enterococcus выявлены в 6 образцах (6/16, 37,5%). Сочетания E. coli и бактерий родов Enterobacter/Klebsiella, а также Enterobacter spp/Klebsiella spp и Enterococcus spp обнаруживались с одинаковой частотой – 3/16, 18,75%. При выявлении трех возбудителей одновременно доминирующим сочетанием было E. coli/Enterococcus spp/(Enterobacter spp/Klebsiella spp) – 7/13, 53,8%.

Обсуждение результатов

В последнее время появляется все больше информации об успешном применении метода ПЦР в качестве быстрой диагностики заболеваний, причиной которых являются бактериальные возбудители. В представленном исследовании рассмотрена возможность применения количественной ПЦР в режиме реального времени для быстрого обнаружения патогенов в моче пациентов с ИМП и бактериурией. Сравнение нового скринингового и традиционного культурального методов исследования мочи показало как сравнительное преимущество, так и ограничения в применимости обоих методов.

Основным недостатком стандартного бактериологического метода диагностики является длительность его исполнения, иногда превышающая 48 часов. В связи с долгосрочностью анализов зачастую пациентам назначается эмпирическая, часто неадекватная антибактериальная терапия либо до получения результатов идентификации патогена в моче, либо вообще без проведения каких-либо процедур, направленных на выявление возбудителя, а также установления его лекарственной чувствительности. Подобная терапия может увеличивать риск развития осложнений. Например, проведенные ранее исследования доказали, что каждый час задержки адекватной противобактериальной терапии пациентов с септическим шоком снижает уровень выживаемости на 8 %. Особенно критично данное положение у пациентов пожилого возраста, детей и лиц с иммунодефицитом.

В сравнении с культуральным методом получение результатов идентификации патогенов методом ПЦР занимает 4–5 часов, что может способствовать раннему назначению этиотропного лечения.

Важным критерием для постановки правильного диагноза является точность идентификации и подсчет количества микроорганизмов в клиническом материале. При подозрении на ИМП и бактериурию нередко в моче обнаруживается полиинфекция. Культуральный метод с применением селективных сред при полимикробной инфекции не лишен погрешностей в связи с невозможностью подбора оптимальных условий культивирования всех возбудителей инфекции, а проведение дополнительных биохимических тестов для определения видовой принадлежности бактерии является процессом трудоемким, дорогостоящим и долговременным.

Преимуществами метода ПЦР, позволяющего выявлять генетические маркеры любых микроорганизмов, является высокая чувствительность и специфичность. В наших исследованиях мы столкнулись с погрешностью идентификации патогенов культуральным методом. В 4-х случаях (4/200, 2,0%) идентификация выявленного возбудителя была проведена некорректно. В 3 мономикробных и 1 полимикробном образцах мочи культуральным методом идентифицированы патогены рода Enterococcus, однако с помощью системы «Энкопол» (Enterococcus faecalis/E. faecium) из набора «Септоскрин» идентифицировать данные микроорганизмы в образцах не удалось. Дополнительная идентификация выросшей мономикробной культуры методом масс-спектрометрии на приборе Autoflex III Smartbeam подтвердила принадлежность данных микроорганизмов к бактериям вида Aerococcus viridans и Lactobacillus crispatus. В одном мономикробном образце по результатам ПЦР тестирования набором «Колипол» была идентифицирована E. coli в количестве 5*103 геном-эквивалентов/мл. В 1 полими-кробном образце мочи согласно результатам ПЦР система «Энтеропол» (Enterobacter spp/Klebsiella spp) указала на присутствие в образце бактерий семейства

Enterobacteriaceae. При дальнейшем исследовании культура была идентифицирована как Escherichia coli в первом случае и Klebsiella pneumoniae во втором методом масс-спектрометрии.

Традиционно, клинически значимым количеством патогенов в моче является 10*4 КОЕ/мл. В последние годы согласно рекомендациям Американского Сообщества Микробиологов (ASM, American Society for Microbiology) и European urinalysis guideline количество патогенов в моче ≥103 КОЕ/мл может интерпретироваться как причина возникновения ИМП или бактериурии, особенно если в моче присутствуют грамотрицательные бактерии (E. coli, Enterobacter spp, P. mirabilis, P. aeruginosa, Serratia marcescens, K. pneumoniae и др.). Мы также проверили значимость полученных данных, принимая во внимание содержание клеток в моче от 10*3 КОЕ/мл и выше.

Количество идентифицированных E. coli в качестве единственного возбудителя, возросло незначительно (с 27 до 29), значительно увеличилось число случаев (с 28 до 36) выявления E. coli методом ПЦР в количестве 10*3геном-эквивалентов/мл и более. Такие же результаты получены при сопоставлении результатов идентификаций бактерий рода Enterococcus. В моноинфицированных пробах при снижении клинически значимого порога до 10*3 КОЕ/мл количество детектированных Enterococcus spp увеличилось с 29 до 33, тогда как с помощью ПЦР «в реальном времени» энтерококки удалось обнаружить в 16 образцах при снижении порога до 10*3 геном-эквивалентов. Остальные выделенные патогены при снижении порога обнаруживались с одинаковой частотой.

Более значимые изменения в результатах наблюдались при исследовании полимикробных образцов с учетом снижения порога до 10*3. Частота обнаружения ДНК E. coli в смешанных образцах возросла с 21 до 29, тогда как результаты микробиологических посевов мочи не изменились. Значительно увеличилось количество детектированных бактерий рода Enterococcus (с 22 до 34 методом ПЦР), Enterobacter spp и Klebsiella spp (с 16 до 25 методом ПЦР) в полимикробных пробах. Также почти в 2 раза возросла частота обнаружения бактерий рода Serratia (с 3 до 7).

Таким образом, при использованием диагностических тест-наборов «Септоскрин» с учетом снижения порога клинической значимости выделенных патогенов до 10*3 геном-эквивалентов/мл частота выявления грамотрицательных патогенов в моче увеличилась на 25%, а грамположительной — на 36,8%.

В 29 образцах при отсутствии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР-диагностики дополнительно было выявлено 42 патогена в количестве 10*3 – 10*4 геном-эквивалентов/мл. Из них 13 были мономикробные образцы и 16 - полимикробные. Среди моноинфицированных проб чаще всего выявляли представителей семейства Enterobacteriaceae (3 E. coli, 6 бактерий KES-группы), энтерококки детектировали в 3 случаях, стрептококки — в 2 случаях, P. aeruginosa – 1, и S. aureus – 1. При анализе 16 полимикробных образцов мочи дополнительно методом ПЦР выявлены бактерии семейства Enterobacteriaceae (E. coli – в 4 случаях, бактерии группы KES – в 9), Enterococcus spp – в 6 случаях, P. aeruginosa — в 3, S. aureus – в 2, Proteus spp — в 1 и стрептококки – в 1. Согласно данным, представленным в ASM

и European urinalysis guideline, титр клеток 10*5 КОЕ/мл и выше обнаруживается у пациентов с ИМП, однако, когда диагноз ИМП является предварительным, и клинические проявления заболевания сохраняются, наличие единственного бактериального возбудителя в моче в количестве менее 10*4 в мл приобретает клиническое значение. Опираясь на данное утверждение, моноинфицированные образцы мочи с низким содержанием бактериальных возбудителей, особенно грамотрицательной флоры, также следует рассматривать как клинически значимые. Вопрос о важности роли грамположительной инфекции в патогенезе ИМП и бактериурии стоит остро при ассоциации микробов, выявлении госпитальных инфекций или при осложненных инфекциях мочевыводящих путей. В нашем исследовании в виде моноинфекции бактерии рода Enterococcus в высоком титре встречались преимущественно у пациентов с диагнозом ОИМП. Грамположительная флора с низким титром часто выявлялась у пациентов с пометкой «обследование», беременных или новорожденных в мономикробных образцах, а также в качестве сопутствующей в полимикробных пробах мочи. Обнаружение стрептококков и энтерококков в невысоком титре в качестве сопутствующей флоры в посевах оставляет вопрос о контаминации мочи и отсутствии значимости данных бактерий в этиологии заболевания. Принимая во внимание сложность забора мочи у грудных детей, а также высокий риск контаминации кишечной флорой, полученные результаты микробиологических посевов мочи можно рассматривать как недостоверные. Стрептококки группы Б, обнаруженные в основном у беременных в малом количестве, не являются сами по себе патогенами, а чаще всего их титр в моче увеличивается на фоне развития грамотрицательной или анаэробной флоры. Грамотрицательная флора, обнаруженная в полимикробных образцах мочи, с низким содержанием клеток в мл также оставляет дискутабельным вопрос о контаминации.

Опираясь на количественные данные, мы сопоставили количество КОЕ/мл, полученные при культуральном методе идентификации, и количество геном-эквивалентов/мл каждого микроорганизма, полученных при пересчете данных после ПЦР. В 11 случаях количество геном-эквивалентов E. coli в мл превышало количество КОЕ, выросших на чашках, на 1,5–2 порядка, других патогенов семейства Enterobacteriaceae — в 9 пробах, энтерококки — в 8 образцах мочи, Proteus spp — в 2, S. aureus и P. aeruginosa – в 1. Мы полагаем, что подобные результаты могут быть получены вследствие начала приема антибактериальных препаратов, назначенных до сдачи мочи на анализ и получения результатов выделения патогенов в моче. При наличии инфекции прием антибактериальных препаратов приводит к уменьшению количества заселяющих мочевыводящий тракт микроорганизмов, вследствие чего титр жизнеспособных клеток в моче при микробиологическом посеве будет ниже. Так как при выделении ДНК все бактериальные клетки подвергаются лизису, количество геном-эквивалентов рассчитывается, исходя из тотального количества ДНК в пробе, что не отражает жизнеспособности бактерий. Принимая во внимание, что моча является достаточно агрессивной средой, не пригодной для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов, количество мертвых клеток в моче могло увеличится также вследствие несоблюдения правил хранения и транспортировки проб мочи с момента взятия материала до момента проведения анализа. Полагая, что бактерии могли погибнуть в моче вследствие длительной транспортировки или при неправильном хранении пробы, можно ожидать, что первоначальный титр жизнеспособных клеток в моче был выше, что дает основания рассматривать результаты ПЦР как истинные, а результаты посевов как ложноотрицательные или заниженные. Особенно актуальным остается этот вопрос при выявлении грамотрицательной флоры. В 12 образцах при наличии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР искомых патогенов обнаружено не было. В 8 случаях преобладала грамположительная флора: в 1 полимикробной пробе мочи, поступившей от беременной, были детектированы 2 патогена в количестве 10*4 КОЕ/ мл: E. faecalis и Streptococcus agalactiae, у 6 пациентов обнаружен энтерококк в титре от 10*4 до 10*5, в 2 пробах детектированы S. agalactiae 10*5 КОЕ/ мл.

Среди оставшихся 4 образцов мочи в 2 пробах зафиксирован рост E. coli и в 2 — представители семейства Enterobacteriaceae. В обоих случаях обнаружения E. coli образцы мочи поступили от женщин 1933 и 1991 года рождения, бактерии выявлены в титрах 10*5 и 10*4 соответственно. Высокий титр дает основание предполагать наличие инфекции в обоих случаях. Из 2 оставшихся проб мочи с выделенными бактериями рода Enterobacter, первый образец получен с пометкой «обследование» от мужчины 65 лет, титр возбудителя составил 10*4 КОЕ/мл. Вторая проба поступила от новорожденного также с пометкой «обследование», титр составил 10*7 КОЕ/мл. При обнаружении в моче новорожденного бактерий в количестве, превышающем 10*4 КОЕ/мл, наиболее вероятно наличие воспалительного процесса. Обнаружение в моче мужчины представителей рода Enterobacter в титре 10*4 и выше указывает на инфекцию мочевыводящих путей. Несмотря на отрицательные результаты ПЦР-тестов и, основываясь на свидетельствах об инфекции согласно полученным положительным результатам микробиологических посевов, данная проблема получения ложноотрицательных результатов ПЦР остается актуальной.

Наиболее важным вопросом при принятии решения о назначении адекватного лечения остается лекарственная чувствительность выделенных бактериальных возбудителей, которая на сегодняшний день может быть определены лишь микробиологическими методами исследования. Методом ПЦР возможно определение только генетически обусловленной устойчивости патогена. Вариантами такой устойчивости среди грамотрицательных микроорганизмов является устойчивость к β-лактамным антибиотикам (гены TEM, SHV, CTX-M, OXA, VIM, NDM) и фторхинолонам (гены GyrA, ParC, QnrA), среди грамположительных микроорганизмов — устойчивость Enterococcus spp к гликопептидам (гены VanA, VanB), устойчивость стафилококков к β-лактамным антибиотикам (ген MecA), устойчивость стрептококков к макролидам (гены Mef и Erm) и фторхинолонам. Из-за долгосрочности выполнения посевов для определения антибиотикоустойчивости выделенных патогенов, наборы для определения чувствительности бактерий методом ПЦР в режиме реального времени представляют собой хорошее дополнение к имеющейся панели реактивов. Разработка и тестирование серии ПЦР-наборов для обнаружения детерминант резистентности является темой для дальнейших исследований. Несмотря на высокую специфичность и чувствительность систем и значительное сокращение времени проведения анализа, очень важным ограничением остается то, что не все патогены, встречаемые в моче, можно детектировать методом ПЦР. Такие возбудители, как Candida sp, Acinetobacter spp, коагулазонегативные стафилококки, Citrobacter spp, Stenotrophomonas maltophilia, Morganella morganii и др., обнаруженные в моче культуральным методом, пропущены при исследовании мочи методом ПЦР «в реальном времени». Подобное ограничение возможно устранить путем создания новых тест-систем.

Фотогалерея

Данная публикация связана со следующими методами диагностики

Данная публикация связана со следующими заболеваниями

Рекомендуемые статьи

Рекоменуем прочитать следующие статьи сотрудников Волынской больницы: