Рутинные тесты для диагностики сифилиса

Прямые методы обнаружения. Самые старые и новейшие методы диагностики сифилиса - это процедуры прямого определения антигена. До того, как был выделен этиологический агент сифилиса, незараженные  люди были инфицированы образцами от инфицированных людей, и их реакции были изучены, чтобы отличить шанкроид от сифилиса и изучить природу заболевания. Различные источники инокулята варьировались от экссудата поражения до крови. Неинфицированному реципиенту была сделана прививка путем однократной или многократной инъекции или путем имплантации биопсийного материала в предплечье или бедро. Несмотря на развитие поражений, точная интерпретация результатов была затруднена из-за разнообразных клинических симптомов сифилиса и отсутствия серологических или микроскопических доказательств инфекции. О первом переносе T. pallidum от человека к яичку кролика было сообщено в 1907 г. Позже исследования на кроличьих инфекциях (RIT) показали, что одна или две трепонемы заразны для 47% кроликов, интратестикулярно инокулированных T. pallidum. Самый старый метод остается самым чувствительным из всех. Новейшая технология, ПЦР, не достигла уровня чувствительности RIT.

Первая ассоциация Spirochaeta pallida, известной тогда как T. pallidum, с заболеванием сифилисом была сделана в 1905 году Шаудинном и Хоффманном, которые использовали модифицированное окрашивание по Гимзе для исследования пораженного материала у людей с каналом. Коулз в 1909 году описал использование темнопольного освещения для исследования S. pallida, особо отметив подвижность организма. Сегодня исследование в темном поле по-прежнему является жизнеспособным методом диагностики сифилиса. В середине 1960-х годов был разработан тест прямого флуоресцентного антитела (DFA) для T. pallidum; позже он был модифицирован для использования с моноклональными антителами и срезами тканей в прямом тесте ткани флуоресцентными антителами для T. pallidum (DFAT-TP).

Нетрепонемные тесты. По совпадению, примерно в то же время, когда наблюдали этиологический агент сифилиса, также разрабатывался первый нетрепонемный тест на сифилис. В 1906 году Вассерманн и др. адаптировали тест связывания комплемента, ранее представленный Bordet и Gengou в 1901 г, для серологического тестирования на сифилис. Антиген, используемый в тесте Вассермана на сифилис, представлял собой экстракт печени новорожденных, умерших от врожденного сифилиса. Первоначально антиген Вассермана считался специфическим, но позже Ландштейнер продемонстрировал, что другие ткани, в частности говяжье сердце, экстрагированное спиртом, могут быть использованы в равной степени в качестве антигенов. Для повышения чувствительности антигенов были добавлены холестерин и лецитин. Хотя тесты на фиксацию комплемента внесли огромный вклад в диагностику сифилиса, они были сложны в выполнении, требовали большого количества реагентов и 24 часов для завершения. Работа Михаэлиса в 1907 году с использованием водянистых экстрактов сифилитической печени и Мейнике в 1917 году с использованием дистиллированной воды или экстрактов хлорида натрия из печени привела к первым тестам на осаждение, которые не требовали дополнения. В 1922 году Кан представил тест на флокуляцию без добавки, который можно было считать макроскопически за несколько часов. Появилось множество модификаций теста Кана, каждая из которых была идентифицирована по имени своего разработчика и каждая требовала большей степени чувствительности или специфичности. Однако недостатком всех этих тестов было то, что их антигены, полученные из экстрактов тканей, полученных грубым способом, различались по качеству. Стандартизация тестов была трудной и основывалась на сравнении с сохраненными образцами сыворотки и контролями антигенов для определения различий в чувствительности и специфичности тестируемых антигенов. Затем в 1941 году Пэнгборн успешно выделил из говяжьего сердца активный антигенный компонент, фосфолипид, кардиолипин. Кардиолипин в сочетании с лецитином и холестерином образует серологически активный антиген для обнаружения сифилитических антител. В отличие от антигенов неочищенного тканевого экстракта, чистые антигены кардиолипин-холестерин-лецитин можно стандартизировать как химически, так и серологически, тем самым обеспечивая более высокую воспроизводимость.

достоверность результатов испытаний как внутри, так и между лабораториями. С появлением этих новых очищенных антигенов были разработаны тесты на микрофлокуляцию, такие как тест Лаборатории исследования венерических заболеваний (VDRL). Эти тесты на флокуляцию, в которых использовались стандартизованные реагенты, дали воспроизводимые результаты, могли быть быстро выполнены, дали приемлемые уровни чувствительности и специфичности и вскоре были преобразованы в методы массового скрининга. Добавление холина хлорида и ЭДТА к антигену VDRL усиливало реактивность теста и стабилизировало суспензию антигена. В результате теста на реагин в охлажденной сыворотке (USR), как следует из названия, необходимость в нагревании сыворотки была устранена, а плазма также оказалась приемлемым источником образца.

Первоначальный экспресс-тест на реагин плазмы (RPR) был разработан как процедура полевого скрининга, при которой можно было быстро протестировать большое количество образцов. Первоначальный RPR был грубым тестом, проведенным на неизмеренном количестве плазмы, но он имел высокую степень реактивности. Тест больше не используется из-за отсутствия специфики и имеет только историческое значение. Тест на плазмакрит был подобен исходному тесту RPR, но использовался остаточная часть плазмы крови из определения микрогематокрита. Поскольку для получения образца не было необходимости в венепункции, этот тест можно было легко провести у младенцев и детей.

Тест RPR с каплевидной картой, дальнейшее усовершенствование теста RPR, был разработан как процедура скрининга, которая будет использоваться в полевых условиях. Лабораторное оборудование не было обязательным, потому что все тестовые материалы содержались в одноразовом наборе. Плазма крови, полученная путем прикосновения пальца, собиралась на карту для сбора плазмы и затем помещалась в тестовую зону в форме капли на карте с пластиковым покрытием. Затем в плазму добавляли стабилизированную суспензию модифицированного антигена RPR, включающую частицы древесного угля для облегчения считывания реакции, и тестовую карту покачивали вручную. Результаты макроскопически считались реактивными или инертными. Тест RPR с каплевидной картой по-прежнему используется в полевых условиях и в качестве процедуры скрининга в некоторых лабораториях, но недавние отчеты показали, что этот тест менее чувствителен, чем используемый в настоящее время тест RPR с 18-миллиметровой круглой картой с сывороткой в ​​качестве источника образца.

В отличие от теста с каплевидной картой RPR, который был разработан для проведения в полевых условиях, тест с круглой картой RPR был разработан для использования в лабораториях, в которых тестирование проводится на большом количестве образцов. В 1960-х годах была разработана автоматизированная версия теста карты RPR: автоматизированный тест на реагин. В автоматизированном тесте реагинов отмеренная часть каждого образца автоматически смешивалась с непрерывным потоком тестового антигена карты RPR. Промывка происходила между каждым образцом, чтобы предотвратить перенос реакционной способности между образцами. Затем часть антигена и смеси образцов наносили на непрерывно движущуюся полосу фильтровальной бумаги. Тест был применим для ежедневной обработки большого количества образцов с низкой степенью реактивности, например, при хранении крови, при поступлении в больницу и добрачном скрининге. В конце 1970-х годов, когда уровень заболеваемости сифилисом резко снизился, многие штаты отказались от добрачных скрининговых тестов, а больницы больше не проводили предварительных тестов; таким образом отпала необходимость в более дорогом автоматизированном методе. Позже были внесены дополнительные модификации в основной антиген, используемый в тесте карты RPR. Подобно тесту с круговой карточкой RPR, тест с толуидиновым красным ненагретой сывороткой (TRUST) и тест на скрининг реагина являются макроскопическими карточными тестами на сифилис.

Лабораторная диагностика сифилиса

Новейшим из нетрепонемных тестов является метод непрямого иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на антигене VDRL.

Трепонемные пробы. Поскольку при нетрепонемных тестах возникают неспецифические или ложноположительные реакции, обычно в результате повреждения ткани хозяина инфекцией, иммунизацией или аутоиммунным заболеванием, поиск специфического серологического теста на сифилис продолжается. Первоначальные попытки разработать тест с использованием антигена, полученного из самой трепонемы, были безуспешными до 1949 года, когда Нельсон и Майер разработали первый тест на трепонемные антитела, тест иммобилизации T. pallidum (TPI). В тесте TPI в качестве антигена используется T. pallidum (штамм Николса), выращенный в семенниках кролика, и он основан на способности антител и комплемента пациента иммобилизовать живые трепонемы, как это наблюдается с помощью микроскопии в темном поле. Тест TPI был быстро принят как специальный тест на сифилис. Однако, поскольку испытание TPI было сложным, технически трудным, трудоемким и дорогостоящим в выполнении, требовалась более простая процедура. Кроме того, исследования 1970-х годов показали, что тест TPI был менее чувствительным и специфичным, чем трепонемные тесты, появившиеся в 1960-х годах. Сегодня в США тест TPI используется только в исследовательских лабораториях.

Как и в случае с нетрепонемными тестами, позже был разработан ряд трепонемных тестов, некоторые из которых пользовались непродолжительной популярностью. В 1953 г. Д’Алесандро и Дарданони получили антиген из T. phagedenis, трепонемы Рейтера, непатогенного организма, который, в отличие от T. pallidum subsp. pallidum можно легко культивировать in vitro. Считалось, что антиген Reiter является трепонемой, специфичной не только для трепонемы Reiter, но также и для T. pallidum subsp. паллидум. При использовании в тесте фиксации комплемента на сифилис антиген Рейтера обнаруживал антитела, отличные от антител, обнаруживаемых нетрепонемными тестами. Наиболее широко используемыми тестами с использованием трепонемы Рейтера или экстракта организма были тест фиксации комплемента белка Рейтера и тест Колмера в пятой части объема с белковым антигеном Рейтера. Однако значительная часть ложноположительных реакций произошла с этими тестами, и последующая оценка показала, что они менее специфичны и чувствительны, чем тест TPI.

В 1957 году произошел крупный прорыв в тестировании трепонемных антигенов с разработкой теста на флуоресцентные трепонемные антитела (FTA). Первоначальная процедура FTA использовала разведение 1: 5 сыворотки пациента в физиологическом растворе, реагировавшего с суспензией убитых трепонем. В качестве конъюгата использовали меченный флуоресцеином иммуноглобулин человека против человека, и результаты теста считывали под микроскопом с источником УФ-света. Когда улучшенное соединение флуоресцеина (флуоресцеина изотиоцианат [FITC]) использовалось для приготовления меченого конъюгата против человеческого глобулина, неспецифические реакции наблюдались примерно в 25% нормальных образцов сыворотки. Чтобы устранить эти ложноположительные реакции, тест был изменен путем разбавления сыворотки пациента 1: 200, FTA-200. Однако тест FTA-200, хотя и высокоспецифичный, не был очень чувствительным. Было обнаружено, что неспецифические реакции исходного теста FTA возникают из-за общих антигенов, общих для T. pallidum, и непатогенных трепонем, которые встречаются как часть нормальной бактериальной флоры человека. Дикон и Хантер, приготовив ультразвуковую обработку культур спирохет Рейтера, удалили общие антигены путем абсорбции; их работа привела к разработке более специфичного и чувствительного теста на абсорбцию FTA (FTA-ABS). В

FTA-ABS и его аналог, тест с двойным окрашиванием FTA-ABS, используемый с микроскопами падающего света (81), сегодня остаются стандартными трепонемными тестами на сифилис.

В 1965 г. Ратлев сообщил о первом надежном применении методов гемагглютинации для серологической диагностики сифилиса. Антиген, использованный в ее процедуре, представлял собой формализованные дубленые эритроциты барана, сенсибилизированные обработанным ультразвуком материалом из T. pallidum (штамм Nichols). Присутствие трепонемных антител в сыворотке крови пациента определяли по непрямой агглютинации сенсибилизированных эритроцитов и последующему образованию мата из эритроцитов при их оседании.