Проточная цитометрия представляет собой технологию, которая обеспечивает быстрый многопараметрический анализ отдельных клеток в растворе. Проточные цитометры используют лазеры в виде источников света для получения как рассеянных, так и флуоресцентных световых сигналов, которые читаются детекторами, такими как фотодиода или фотоумножимые трубки. Эти сигналы преобразуются в электронные сигналы, которые анализируются компьютером и записаны в стандартизированный файл данных формата FCS. Популяции клеток могут быть проанализированы и очищены на основе флуоресцентных характеристик рассеивания света.

Разнообразные флуоресцентные реагенты используются в проточной цитометрии. К ним относятся флуоресцентно сопряженные антитела, связывающие ДНК, красители ионного индикатора и белки флуоресцентной экспрессии.

Проточная цитометрия является мощным инструментом, обладающим применением в иммунологии, молекулярной биологии, бактериологии, вирусологии, биологии рака и мониторингу инфекционного заболевания.

Проточная цитометрия - это технология, которая быстро анализирует отдельные клетки или частицы, поскольку они проходят мимо одного или нескольких лазеров, при при суспендированном в буферизованном растворе на основе соли. Каждая частица проанализирована для разброса с видимым светом и одному или множеству параметров флуоресценции. Видимый светильник Scatter измеряется в двух разных направлениях, прямое направление (рассеивание вперед или FSC), которое может указывать на относительный размер ячейки и при 90 ° (боковой разброс или SSC), что указывает на внутреннюю сложность или гранулярность клетки. Свет разброса не зависит от флуоресценции. Образцы готовят к измерению флуоресценции посредством трансфекции и экспрессии флуоресцентных белков (например, зеленый флуоресцентный белок, GFP), окрашивая флуоресцентными красителями (например, йодид пропида, ДНК) или окрашивая флуоресцентными сопряженными антителами (FITC CD3).

Проточная цитометрия является мощным инструментом, который имеет применения в нескольких дисциплинах, таких как иммунология, вирусология, молекулярная биология, биология рака и мониторинг инфекционного заболевания. Например, он очень эффективен для изучения иммунной системы и его реакции на инфекционные заболевания и рак.

Приборы, используемые для проточной цитометрии, развивались в течение последних нескольких десятилетий. Несколько лазерных систем распространены как инструменты, предназначенные для конкретных целей, таких как системы с 96-луночными погрузчиками, предназначенными для анализа из бисера, систем, которые объединяют микроскопию и проточную цитометрию и системы, которые объединяют масс-спектрометрию и проточную цитометрию.

Увеличение имеющихся реагентов в течение последних нескольких лет привело к у росту в количества параметров, используемых в экспериментах проточной цитометрии. Существует драматическое увеличение фторухромов, используемых для сопряженных моноклональных антител, таких как тандемные красители и полимерные красители. Кроме того, произошло увеличение доступных флуоресцентных белков, используемых для трансфекции, таких как MCHERRY, MBANANA, MORANGE, MNETTUNE и т. д. Эти достижения в флуорохромах и приборостроении привели к экспериментам с возможностью выявления более 30 параметров биологических маркеров.

Заключительной частью проточной цитометрии эксперимента является анализ данных. Традиционные две гистограммы параметров (точка участок) стробирования и анализ до сих пор используются часто. Тем не менее, увеличение числа параметров и сложностей в экспериментах приводят к использованию алгоритмов анализа данных кластера такой РС, и tSNE. Эти усовершенствованные методы добычи данных позволяют полезной информации, которая будет извлечена из многомерных данных стать доступной с помощью проточной цитометрии.

Традиционные проточные цитометры

традиционные проточные цитометры состоят из трех систем: флюида, оптика и электроника. Система для жидкости состоит из жидкости оболочки (обычно буферизованного солевого раствора), которая находится под давлением для доставки и фокусировки образца к лазерному перехвату или точке допроса, где анализируется образец. Оптическая система состоит из оптики возбуждения (лазеров) и оптики сбора (Photomultiplier или PMTS и фотодиоды), которые генерируют видимые и флуоресцентные световые сигналы, используемые для анализа образца. Серия фильтров направляет флуоресцентный свет к конкретным детекторам и полосу фильтров, определяя длины волн света, которые считаются так, чтобы каждый отдельный фторохром мог быть обнаружен и измерен.

Несколько лазерных систем распространены приборами, часто имеющими 20 параметров (FSC, SSC и 18 флуоресцентных детекторов). Существуют новые инструменты платформы, которые вводятся с пятью или более лазерами и 30-50 параметрами, но они менее распространены. Наиболее распространенные лазеры, используемые в традиционных потоках цитометров, являются 488 нм (синий), 405 нм (фиолетовый), 532 нм (зеленый), 552 нм (зеленый), 561 нм (зеленый желтый), 640 нм (красный) и 355 нм (ультрафиолетовый) Отказ Дополнительные лазерные длины волн доступны для специализированных приложений. Кроме того, есть инструменты, которые заменили PMTS с помощью лавинных фотодиодов (APD) для обнаружения флуоресценции с целью увеличения чувствительности.

Акустические фокусирующие цитометры - этот цитометр использует ультразвуковые волны для лучшего фокусировки клеток для лазерного допроса. Этот тип акустической фокусировки обеспечивает более высокий ввод образца и меньше засорения образца. Этот цитометр может использовать до 4 лазеров и 14 каналов флуоресценции.

Сортировщики клеток - конкретный тип традиционного проточного цитометра является сортировщик клеток, который может очищать и собирать образцы для дальнейшего анализа. Сортировщик клеток позволяет пользователю выбрать (ворота) на популяцию клеток или частиц, которые являются положительными (или отрицательными) для желаемых параметров, а затем направляют те клетки в сосуд для сбора. Сортировщик клеток разделяет клетки, колеблюсь от потока образца жидкости на высокой частоте для генерации капель. Затем капли задают либо положительный, либо отрицательный заряд и пропускают через металлические прогибные пластины, где они направлены на определенный сосуд для сбора на основе их заряда. Сосуды сбора могут быть трубки, слайды или пластины (96-луна или 384-луна).

Существует два типа сортировщиков клеток, кварцевая кювета и «реактивный в воздухе», которые отличаются тем, где расположена лазерная точка допроса. Сортировщики клеток Кварцевых кюветы имеют фиксированные лазерные выравнивания. Уборщики клеток «Jet in Air» должны быть ежедневно выровнены лазерами и сложнее настроить, но более адаптируются для детектирования мелких частиц.

Визуализация цитометров-визуализации проточных цитометров (IFC) объединяют традиционную проточную цитометрию с флуоресцентной микроскопией. Это позволяет быстро анализ образца для морфологии и многопараметрической флуоресценции как на единой ячейке, так и на общей площади плашкиМФК может отслеживать распределения белка внутри отдельных клеток, таких как конфокальный или флуоресцентный микроскоп, но и для обработки большого количества клеток, таких как цитометр потока. Они особенно полезны в нескольких приложениях, таких как сигнализация клеток, исследования совместных локализации, ячейки к взаимодействиям клеток, повреждение и ремонт ДНК и любое применение, которое необходимо иметь возможность координировать ячее место с выражением флуоресценции на больших популяциях клеток.

Микробиологический анализатор BactoSCREEN анализирует специфические белки бактерий с помощью масс-спектрометрии. Небольшое количество микроорганизмов наносится на плашку и после высушивания смешивается с раствором матрицы, который экстрагирует из исходного материала преимущественно рибосомные белки. Матрица играет ключевую роль, так как она передает протоны белкам.

При облучении лазером с длительностью импульса несколько наносекунд и высокими величинами интенсивности излучения (106 — 107 Вт/см²) из образца, представляющего собой твердый раствор или смесь анализируемого вещества и матрицы, происходит выброс материала в виде ионов положительно заряженных белков. Эти частицы электростатически ускоряются и влетают в пролетную трубу со специфической скоростью, а затем ударяют в детектор. Все ионы получают одинаковое ускорение, однако, из-за разницы в массе они развивают разную скорость. Таким образом, появляется возможность точно измерить соотношение массы и заряда, присущее данному образцу.

Далее происходит построение графика: по оси абсцисс откладывается масса ионов (точнее, величина отношения массы иона к его заряду), а по оси ординат – их интенсивность, т.е. относительное количество ионов данного вида. Принято выражать интенсивность в процентах к полному ионному току (суммарной интенсивности всех ионов в спектре) или к интенсивности максимального иона. Получившийся спектр является видоспецифичным . Он автоматически сравнивается со справочными величинами из библиотеки, содержащей все известные спектры, характерные для разных микроорганизмов.

 Процент совпадений дает возможность оценить достоверность идентификации. При 80-100% микроорганизм определяется с точностью до вида, при 50-70% - только до рода. При количестве совпадений менее 50% идентификация считается невыполненной.

7 декабря 2021 г.

Ещё больше полезной информации на нашем Телеграм-канале

Эта статья...
Читайте также
Ещё статьи из категории «Полезные статьи»
Когда болит горло…
Когда болит горло…
Боль в горле – самая частая жалоба на амбулаторном приеме врача – оториноларинголога. Так же это довольно частая причина обращения в аптеки пациентов для...
Особенности течения второй волны новой коронавирусной инфекции COVID-19
Особенности течения второй волны новой коронавирусной инфекции COVID-19
Анализ течения второй волны новой коронавирусной инфекции COVID-19, выявление особенности клинико-лабораторных показателей в группах больных, отличающихся...